Après plusieurs années passées dans une dangereuse bande de hors-la-loi, John Marston a décidé de se ranger et de vivre paisiblement dans son ranch avec sa femme Abigail et son fils Jack. Malheureusement, l’agent Edgar Ross du FBI ne l’entend pas de cette oreille. Il emprisonne Abigail et Jack et ne les rendra à John que s’il arrête mort ou vif tous les anciens membres de sa bande : Bill Williamson, Javier Escuela et son chef Dutch Van Der Linde. John accepte à contrecœur.

John part d’abord pour New Austin où Bill Williamson et sa bande sèment la terreur depuis leur planque : Fort Mercer. Il rencontre plusieurs personnes qui lui viendront en aide : Bonnie MacFarlane, une femme forte qui s’occupe du ranch de son père ; le marshall Johnson, qui tente de protéger les habitants de la ville d’Armadillo contre Williamson ; Nigel West Dickens, un charlatan créatif qui essaye de vendre un « remède miracle » aux habitants de la région ; Seth, un pilleur de tombes psychopathe en quête d’un trésor ; et l’Irlandais, un trouillard alcoolique aux mauvaises fréquentations. En échange de nombreux services, ces personnages aideront John à prendre d’assaut le Fort Mercer. Mais durant l’attaque, Williamson parvient à s’enfuir. John part donc pour le Mexique avec l’Irlandais et compte bien y retrouver Williamson et Javier Escuela.

John se rend à la ville de Chuparosa où il fait la connaissance d’une légende de l’Ouest : Landon Ricketts. Le vieux cow-boy a décidé de défendre les habitants de la région contre les excès du gouverneur local : le colonel Allende. Certains habitants de la région se sont même rassemblés derrière le révolutionnaire Abraham Reyes pour renverser le tyran local : nous sommes dans les prémices de la révolution mexicaine. Mais John ne fait pas de politique : il alterne les missions pour le compte de Luisa, une des maîtresses de Reyes (que John sauvera même du peloton d’exécution) et pour le capitaine De Santa, l’âme damnée d’Allende (John mènera les troupes mexicaines lors de la reprise du fort de Torquemada), tout cela dans l’espoir qu’un des deux camps lui livrera Williamson et Escuela. Mais ses deux anciens complices sont protégés par Allende qui décide de trahir John. Sauvé in extremis par Reyes, John rejoint la rébellion. Après avoir tué De Santa, il retrouve Escuela qu’il tue ou capture (au choix du joueur) et livre à Ross. John et Reyes marchent ensuite sur Escalera, la capitale de la région. Luisa est tué au cours de la bataille et John parvient à éliminer Williamson et Allende.

John part ensuite pour West Elisabeth pour retrouver sa dernière cible. Avec l’aide du naturaliste Harold MacDougal, il découvre que Dutch Van Der Linde, tombé dans la folie, a pris la tête d’un groupe de bandits indiens. Aux côtés de Ross et des forces américaines, John prend d’assaut le repaire de Dutch qui préfère se suicider plutôt que de tomber dans les mains de la police.

Ross tient sa promesse et John retrouve Abigail et Jack. Avec l’aide de sa femme, de Bonnie et d’un vieil homme qu’il appelle l’Oncle (sans qu’il n’ait de lien de parenté), il essaye de faire prospérer son ranch et d’élever son fils Jack. Mais un jour, Ross, à la tête d’une compagnie américaine, prend d’assaut le ranch. Après avoir éliminé Williamson, Escuela et Dutch, il compte bien en finir avec le dernier membre de la bande. Après avoir mis sa femme et son fils en sécurité, John signe son arrêt de mort, sort du ranch, tient tête à une vingtaine voire une cinquantaine d'hommes (en utilisant la technique de Landon Ricketts) qui l'attendent armés jusqu'aux dents.

Trois années plus tard en 1914, alors que sa mère vient de mourir et que la Première Guerre mondiale vient d’être déclarée en Europe, Jack, devenu un adulte, part à la recherche de Ross, qui a pris sa retraite. Après l’avoir retrouvé au Mexique, là où il était parti chasser, il le tue en duel et venge ainsi son père.